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ELISA檢測(cè)e抗原的原理
免疫原性是抗原zui重要的性質(zhì),它主要取決于物質(zhì)本身的性質(zhì)及其與機(jī)體的相互作用。由于自然界中各種生物體都有其各自特異性的抗原,因此抗原性物質(zhì)的種類繁多,根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以對(duì)其進(jìn)行分類,分類方法也十分復(fù)雜。
E抗原是從乙肝表面抗原(HBsAg)陽性血清中發(fā)現(xiàn)的一種新抗原,他可能與乙型肝炎的傳染性有密切關(guān)系。李羽等報(bào)道用ELISA檢測(cè)e抗原的靈敏度比瓊脂免疫擴(kuò)散法高150—300倍。試驗(yàn)程序:
1.病人免疫球蛋白IgG(e抗體)的提取:用飽和硫酸銨沉淀法處理上述抗體陽性人血清所得粗提液過柱(DEAE-Cellulose)收集IgG陽性部分,再穿流正常人血清柱。得IgG(e抗體),濃縮為5ng/ml貯藏放于冰箱中。
2.酶標(biāo)記IgG(e抗體)的制備:用戊二醛二步法,將10mg HRP交聯(lián)5 mg IgG(e抗體),分裝于小瓶,在低溫(-20°C)下保存。
3.ELISA對(duì)e抗原的檢測(cè):
a. IgG(e抗體)包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板,在4°C過夜(IgG濃度為25r/ml)。
b.洗滌3-5次。
c.加待檢病員血清(1:10稀釋,每份標(biāo)本加兩孔,每孔0.1ml,37°c孵育2h).
e.洗滌3-5次。
f.加酶標(biāo)記IgG(e抗體),37°C孵育2h(酶標(biāo)記IgG稀釋度為1:640)。
g.洗滌3-5次。
h.加底物與供氫體(H2O2與OPD),置于暗處反應(yīng)30min.
i.加2mol/L硫酸終止反應(yīng)。
j.每板均設(shè)陽性與陰性對(duì)照,根據(jù)不同的顯色反應(yīng)予以判斷。
k.經(jīng)過上訴方法檢測(cè)初步確定為陽性的標(biāo)本,取兩份,一份加足量的e抗體血清,另一份加正常人血清,在37°C孵育1h,然后再按上述方法測(cè)定e抗原。加e抗原體血清者,在顯色反應(yīng)受到控制(與正常血清對(duì)比)時(shí)才可判斷為e抗原陽性。
雖然ELISA法在理論上十分簡單,但每一步都有要注意的事項(xiàng)。不論是新設(shè)計(jì)的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方面技術(shù)要點(diǎn):固相載體的選擇和試劑的制備,反應(yīng)條件和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。